活性氧檢測試劑盒是一種基于熒光染料DCFH-DA(2,7-Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate)的熒光強度變化，定量檢測細胞內活性氧水平的常用方法。
 

　　下面讓我們來了解一下活性氧檢測試劑盒的操作過程吧
 

　　一、裝載探針
 

　　1、原位裝載探針(僅適用于貼壁細胞)
 

　　1)細胞準備：檢測前一天進行細胞鋪板，確保檢測時細胞匯合度達到50~70%。
 

　　注：必須保證細胞狀態健康，且檢測時不會過度生長。
 

　　2) 藥物誘導：去除細胞培養液，加入適量經合適的緩沖液或無血清培養基稀釋到工作濃度的藥物，于37℃細胞培養箱內避光孵育，具體誘導時間根據藥物本身特性，以及細胞類型來決定。
 

　　陽性對照：先用無血清培養基等稀釋陽性對照(Rosup, 100 mM)到常用工作濃度100 μM，加入細胞，一般37℃避光孵育30 min-4 h可顯著看到活性氧水平提高，但依細胞類型會有比較明顯差異。(如，HeLa細胞孵育30 min;MRC5人胚胎成纖維細胞1.5 h;)
 

　　3)探針準備：探針裝載前按照1:1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。
 

　　4) 探針裝載：吸除誘導用藥物，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA工作液。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜。例如;對于6孔板通常不少于1000 μL，對于96孔板通常不少于100 μL。37℃細胞培養箱內避光孵育30 min。
 

　　5) 細胞清洗：用無血清培養液洗滌細胞1~2次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。
 

　　2、收集細胞后裝載探針：適用于貼壁細胞和懸浮細胞。
 

　　1) 細胞準備：按照標準方法培養細胞，必須保證檢測用細胞狀態健康。按照適當方法，清洗并收集足量的細胞。
 

　　2)藥物誘導：將收集好的細胞懸浮于適量稀釋好的藥物，于37℃細胞培養箱內避光孵育，具體誘導時間根據藥物本身特性，以及細胞類型來決定。(可選)陽性對照：先用無血清培養基等稀釋陽性對照(Rosup, 100 mM)到常用工作濃度100 μM，加入細胞，一般37℃避光孵育30 min-4 h可顯著看到活性氧水平提高，但依細胞類型會有比較明顯差異。【如，HeLa細胞孵育30 min;MRC5人胚胎成纖維細胞1.5 h;】
 

　　3) 探針準備：探針裝載前，按照1:1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。
 

　　4) 探針裝載：去除細胞內藥物，離心收集細胞，加入適當稀釋好的探針，使其細胞密度為1.0×106~2.0×107。
 

　　注：細胞密度需根據后續的檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來進行調整。如，對于流式分析，單管檢測內細胞數目不少于104，也不可多于106。每隔3-5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。
 

　　5)細胞清洗：用無血清細胞培養液洗滌細胞1~2次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。
 

　　二、檢測
 

　　原位裝載探針法：激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。
 

　　收集細胞后裝載探針：用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。